在高效液相色譜中，溶劑是指用于制備流動相、溶解和輸送樣品的溶液。流動相是影響HPLC的性能的主要因素，它的性質必須滿足HPLC測試的嚴格要求。在選擇溶解樣品的溶劑和其他與制備樣品有關的溶劑時，同樣也需考慮這些溶劑的性質與檢測器的兼容性。

在樣品的檢測波長下，所選流動相的吸光度最好是A<0.2AU，特別是在梯度洗脫中，較低的吸光度意味著能獲得更好的檢測精度和更好的結果。但是，在等度洗脫中吸光度稍高的溶劑也是可以接受的。選用紫外檢測波長低于200nm的溶劑是很罕見的，除非是用于檢測那些在高于200nm波長處吸光度低的物質。

因為水在大于等于200nm波長都無紫外吸收，所以含水流動相的吸光度，等于純溶劑的吸光度乘以流動相B溶劑的體積分數(shù)φ。例如，在215nm波長，當B為以下各種不同溶劑時，含有25％B溶劑的流動相的吸收值A分別對應：乙腈，0.00AU；甲醇，0.09AU；脫氣甲醇，0.05AU；*，0.22AU；異丙醇，0.07AU。注意，脫氣甲醇降低了氧氣在純溶劑中的濃度，導致在200～240nm波長下，吸光度降低了接近1/3。當用充氦氣的方法進行流動相脫氣后，由于溶劑中氧氣含量的比例下降，流動相中的B溶劑吸光值也會降低。氧氣在低極性溶劑（如*和異丙醇）中溶解度更高，因此，在實踐當中，低極性溶劑的吸光值可能會比理論值更高。（理論值見<液相色譜方法開發(fā)中紫外吸收波長的選擇>）

水在波長≥200nm時無吸收，這是假定水是經(jīng)過嚴格純化的。HPLC級水在ASTM D1193中有詳細說明。在低波長中檢測，有時不但會要求水中的總有機碳（TOC）低于50ppb，而且要有足夠高的電阻率。

在等度洗脫中，流動相的選擇通常不受RI檢測器的限制。可通過選擇折光率跟樣品成分折光率有較大差異的流動相，從而提高檢測靈敏度。基于差分測量的檢測器（如：RI）不能用于梯度洗脫。因為通常情況下A、B溶劑之間的響應值相差很大。

流動相在MS接口蒸發(fā)，流動相一般由水、有機溶劑組成，揮發(fā)性添加劑的使用也很常見（添加劑不能是非揮發(fā)性緩沖劑或鹽）。因為已經(jīng)去除流動相，所以在LC-MS中并不存在流動相的紫外吸收，但是溶劑中不能有顆粒存在。