各種凝膠在結(jié)構(gòu)上是很相似的，都是三維空間網(wǎng)狀交織的高分子聚合物。分離程度主要取決于凝膠顆粒內(nèi)部微孔的孔徑和混合物的分子量這兩個(gè)因素。微孔孔徑的大小與凝膠物質(zhì)中凝膠濃度的平方根呈反比，與凝膠聚合物分子的平均直徑呈正比（其聚合物分子近似地當(dāng)做球形）。和凝膠孔徑直接關(guān)聯(lián)的是凝膠的交聯(lián)度，交聯(lián)度越高，孔徑越小；反之，孔徑就大。移動(dòng)緩慢的小分子物質(zhì)，在低交聯(lián)度的凝膠上不容易分離，大分子同小分子物質(zhì)的分離也宜用高交聯(lián)度的凝膠。葡聚糖凝膠的交聯(lián)度隨每克干燥凝膠的吸水量的增加而遞減。

根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況決定洗脫液的流速，一般采用30~200mL/h。流速過快會使色譜帶變形，影響分離效果，流速的調(diào)節(jié)可采用靜液壓法裝置。

非水溶性物質(zhì)的洗脫，采用有機(jī)溶劑，水溶性物質(zhì)的洗脫，一般采用水或具有不同離子強(qiáng)度和pH的緩沖液。離子強(qiáng)度的變化，對于物質(zhì)的分離有不同的影響。在洗脫堿性蛋白時(shí)，洗脫劑中必須含有一定濃度的無機(jī)鹽，而且隨著鹽濃度的增加，移動(dòng)加快。pI低于7的蛋白質(zhì)的洗脫，很少受離子強(qiáng)度變化的影響。在酸性pH時(shí)，堿性物質(zhì)易于洗脫。多糖類物質(zhì)洗脫以水最佳。

凝膠色譜很少用在分離純化的開始階段。為了達(dá)到良好的分離效果，柱子的上樣量必須保持較小的體積。對于蛋白質(zhì)來說，上樣量通常為柱體積的2%~5%。樣品中含有雜質(zhì)太多時(shí)就有可能堵塞柱子。凝膠色譜通常用在分離純化的最后階段，此時(shí)的目的產(chǎn)物已經(jīng)比較純，濃度較高。樣品加到色譜柱后，選用合適的洗脫液進(jìn)行洗脫，通常目的產(chǎn)物被稀釋很多倍。